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【新闻】蜂毒肽分子生物学研究新进展

2019年12月06日已有人阅读病友分享我想学蜂疗

【39蜂疗网讯】近年来研究发现蜂毒肽具有抗肿瘤、抗艾滋病毒的作用，引起了人们的极大关注。

蜂毒肽 (melittin)亦称蜂毒溶血肽，是一种昆虫抗菌肽 , 是意大利蜂蜂毒的主要成分之一，占蜂毒干重的50%，是蜂毒中的主要多肽成分，不仅具有抗菌、消炎、抗关节炎等作用，对辐射还有预防和治疗作用，可使受辐射动物的生存率提高20%～60%[1]。

一、蜂毒肽的结构

蜂毒肽由26个氨基酸残基组成，是由蜜蜂毒腺中合成的蜂毒肽前体蛋白 (promelittin)经二肽蛋白酶水解而成的，其相对分子质量为2 849，氨基酸的排列顺序为：甘-异亮-甘-丙-缬-亮-赖-缬-亮-苏-苏-甘-亮-脯-丙-亮-异亮-丝-色-异亮-赖-精-赖-精-谷-谷，具有强碱性，pH10，溶于水。

蜂毒肽在水中存在2种形式，即在低浓度、低离子强度形成单体的自由结构；在高浓度、高离子强度则形成四聚体。

蜂毒肽的构象通过X-射线晶体衍射观察呈螺旋-弯曲-螺旋结构，弯曲部位于第11～15氨基酸残基，1～10残基与16～26残基形成的二螺旋的轴线间的交角约为120°。

从氨基-末端起前20个残基中只有7位的K残基带电荷，此部分呈高度流水性。相反，羧基-末端的6个氨基酸残基部分是高度阳离子化，有2个K残基，两个R残基，两个Q残基；氨基-末端的螺旋则是兼性的[2] 。

二、蜂毒肽的功能

1.蜂毒肽的抗菌作用

蜂毒肽具有广谱杀菌作用，能抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性病原微生物的发育，尤其对耐药菌株有明显抑杀作用。

Juvvadi[3]通过对天蚕素A和蜂毒肽杂合体的抗菌作用研究，推测其抗菌作用首先是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间的相互作用，继而是与膜上的碳氢化合物的相互作用，然后肽分子的疏水α-螺旋插入膜上，聚合成孔道，导致内容物外泻，细菌死亡。

2.蜂毒肽的抗艾滋病毒作用

抗菌肽是先天性免疫的效应器，使宿主对寄生物迅速产生非特异性的抵抗力。蜂毒肽以剂量依赖方式减少持续感染人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的T淋巴瘤细胞HIV-1产物的量。蜂毒肽通过其胞内作用减小病毒感染性。蜂毒肽被摄入胞内，使gag/pol前体的加工被削弱[4] 。

Wachinger[5]1998年报道的研究结果表明，蜂毒素和天蚕素可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达，从而减少HIV-1的增殖。这种抑制作用，对于细胞游离病毒有剂量依赖性。对于细胞联合病毒的研究发现，蜂毒素可使Gag抗原和HIV-1mRNA减少，蜂毒素和天蚕素可以抑制HIV LTR(HIV long terminal repeat)的活性。这表明蜂毒素对于当今人类的顽症 ——艾滋病有抑制作用。

3.蜂毒肽的抗肿瘤作用

蜂毒肽具有膜活性，直接对细胞的磷脂膜起溶解作用，抑制细胞发育，对肿瘤细胞（淋巴瘤、肉瘤）有强烈的细胞毒素作用。蜂毒肽抗肿瘤的作用机制众说纷纭，Saint[6]发现蜂毒肽裂解人单核细胞性白血病细胞U937是通过激活内源性磷脂酶D而致。

Arora[7]证明蜂毒素激活磷脂酶A2(PLA2)，解除肝癌细胞对缺氧的抵抗。Kubo[8]发现蜂毒肽可杀伤K562和HL-60细胞，蜂毒素插入K562细胞的胞膜中形成孔道，引起Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，细胞裂解[9]。

蜂毒肽可诱导大鼠神经角质瘤C6细胞HSP27和HSP70的表达[10]，HSPs是CN8+T细胞应答诱导辅助分子[ 11]，参与抗肿瘤T细胞应答，有望成为抗肿瘤T细胞免疫疗法的靶分子[12]。

蜂毒素通过增加Ca2+内流高度激活ras转化细胞的PLA2，选择抑制其ras蛋白表达水平和ras基因的拷贝数，同时使其向正常形态逆转。

也有人认为蜂毒肽优先激活ras癌基因转化细胞的PLA2，致其选择性破坏[13]。

总之，蜂毒肽具有对肿瘤细胞的选择性杀灭作用 , 又具有相对分子质量小、热稳定性、无免疫原性等特点，极有可能成为无(低)毒副作用的抗肿瘤新药。

三、蜂毒肽的基因工程

蜂毒肽 (meittin)由26个氨基酸残基构成，但它不是rnRNA直接表达的产物。最初rnRNA翻译产物是Pre -Promelittin有70个氨基酸，蜂毒肽(meittin)位于COOH一端(第44-69)，N一端开始于疏水的“pre”区，共21个残基，接下来是独物的“Pro”区，只含有Ala、Pro及酸性残基。Pre-promelittin需经过三步翻译后的加工过程，才能最终形成蜂毒肽 (meittin)[18] 。

Vlasak等[14](1983)用Kindas-Mugge等的方法，分离并提纯了蜂毒肽rnRNA，又用mRNA※cD-NA反转录方法，合成了蜂毒肽的cDNA，然后将合成的双键cDNA克隆到pBR322和pUC8质粒上，转化大肠杆菌。

张青文等[15]从1991年开始分离提取了蜂毒的rnRNA，并将纯化后的蜂毒肽rnRNA注入棉铃虫卵中进行转译，成功地合成了Promelittin。

该物质为蜂毒肽的前体，比蜂毒肽多8个氨基酸，用二肽蛋白酶IV可以裂解Promelittin，从而释放蜂毒肽[16] 。

李继周等[17]于1997年通过mRNA ※cDNA 反转录的方法, 合成了蜂毒肽基因，并将其克隆到表达载体λgt11上，建立了蜂毒肽cDNA文库，利用抗体探针筛选出能够表达蜂毒肽的阳性克隆，经用PCR扩增和产物免疫反应进行检测，证明蜂毒肽的cDNA克隆成功，并得到表达。

陈仲兵等[18] (1998)在上述工作基础上，分离蜂毒肽基因，并将它克隆到大肠杆菌中。

王关林等[19] (2000)从蜜蜂毒腺中提取总RNA，通过RT-PCR 方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，再进一步通过定点诱变在蜂毒肽序列前引入了羟胺裂解位点，构建了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽诱变蛋白表达载体，序列分析结果表明，成功地引入了目的密码子，且与β-半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框，并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白。

2001年王关林等[20]克隆了蜂毒肽前体蛋白的cDNA , 并在大肠杆菌中表达了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前体蛋白。

2001年王秋波等[21] 报道通过人工合成含特异性酶切位点的AB两条寡核苷酸片段，在Klenow酶作用下形成目的基因, 用限制性内切酶Hind III，Xmn I同时酶切目的基因和表达载体Pmalp2质粒，在T4连接酶的作用下构建两者的重组体 , 通过α-互补筛选出阳性克隆，并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定，获得重组蜂毒肽的原核表达克隆。

目前，人们主要通过从蜜蜂毒液中分离提取或化学合成来获得蜂毒肽。但因为磷脂酶A2的存在而造成的纯化困难和蛋白质化学合成的高成本，使蜂毒肽的广泛应用受到了限制。

而生物工程技术的发展为生产蜂毒肽提供了一条新的途径。通过基因工程的方法获得蜂毒肽的尝试，已取得一定进展，但这只是一个起步，距离大规模生产还有很长一段路。如何进一步提高表达水平，提高基因表达产物的稳定性等，都是值得深入研究的问题。

转载于天之力医药

作者：孙丽萍董捷闫继红王凤忠吴粹文