蜂疗网【论文汇编】PCDH18在脑胶质瘤中的临床意义及蜂毒肽的调控作用
本文摘自：世界蜂疗大会论文集
{ 今日论文 }
—— PCDH18在脑胶质瘤中的临床意义及蜂毒肽的调控作用 ——
李然1，李万瑶2，郭葵1，徐长琼1*（1韶关学院，广东 韶关 512005；2广州中医药大学，广东 广州510405）
【摘要】目的 探讨PCDH18在脑胶质瘤中的表达及其与预后、免疫细胞浸润的关系；蜂毒肽对脑胶质瘤U87细胞中PCDH18基因表达水平的影响。方法 TCGA数据库分析多种肿瘤组织中PCDH18 mRNA的表达水平；GEPIA2数据库、HPA数据、TIMER数据库和LinkedOmic数据库分别分析PCDH18 mRNA的表达水平与脑胶质瘤患者的生存状态的关系，PCDH18与肿瘤组织中免疫细胞浸润水平的相关性。结果 本研究表明，PCDH18在脑胶质瘤高表达（P<0.05）。PCDH18高表达在LGG患者中位生存时间降低P<0.001)。脑胶质瘤中, PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性，PCDH18与PD-1 和PD-L1均呈正相关。PCDH18 mRNA(高表达）是脑胶质瘤患者预后的独立危险因素（P<0.05），与脑胶质瘤患者的预后密切相关。qPCR结果表明蜂毒肽能下调PCDH18在胶质瘤U87细胞中的高表达。结论 PCDH18可作为脑胶质瘤患者预后不良的标志物，与肿瘤免疫细胞浸润相关。PCDH18基因过表达与生存率低相关。qPCR证实蜂毒肽可以下调PCDH18基因在胶质瘤U87细胞中的高表达，蜂毒肽可能是一种治疗胶质瘤的潜在药物。
【关键词】脑胶质瘤；PCDH18；蜂毒肽；预后
Abstract：Objective To investigate the expression of PCDH18 in glioma and its relationship with prognosis and immune cell infiltration. Effect of melittin on PCDH18 gene expression in U87 cells of brain glioma. Methods The expression level of PCDH18 mRNA in various tumor tissues was analyzed by TCGA database. GEPIA2 database, HPA database, TIMER database and LinkedOmic database were used to analyze the relationship between the expression level of PCDH18 mRNA and the survival state of brain glioma patients, and the correlation between PCDH18 and the level of immune cell infiltration in liver cancer tissues. Methods The expression level of PCDH18 mRNA in various tumor tissues was analyzed by TCGA database. GEPIA2 database, HPA database, TIMER database and LinkedOmic database were used to analyze the relationship between the expression level of PCDH18 mRNA and the survival state of brain glioma patients, and the correlation between PCDH18 and the level of immune cell infiltration in liver cancer tissues. Results This study showed that PCDH18 was highly expressed in brain glioma (P<0.05). High expression of PCDH18 decreased median survival time in LGG patients (p<0.001). In brain glioma, PCDH18 was correlated with the infiltration level of immune cells in the tumor microenvironment, and PCDH18 was positively correlated with PD-1 and PD-L1. PCDH18 mRNA(high expression) was an independent risk factor for the prognosis of brain glioma patients (P<0.05), and was closely related to the prognosis of brain glioma patients. The results of qPCR showed that melittin could regulate the expression of PCDH18 in glioma U87 cells. Conclusion PCDH18 can be used as a marker of poor prognosis in glioma patients and is associated with tumor immune cell infiltration. Overexpression of PCDH18 is associated with low survival. qPCR confirmed that MT can regulate the expression of PCDH18 gene in glioma U87 cells, and melittin may be a potential drug for the treatment of glioma.
Key words: glioma; PCDH18；Bee venom peptide; prognosis
概述
脑胶质瘤是最常见的原发性脑恶性肿瘤，该病发病率高，生存率低[1,2,3]。其中，低级别胶质瘤占成人原发性中枢神经系统肿瘤的6%，预后良好[4]。但与其他颅内良性肿瘤相比，仍有较高的复发率。多形性胶质母细胞瘤(GBM)被WHO列为4级，是最具侵袭性和恶性的原发性脑肿瘤，手术是治疗的重要手段。然而，由于胶质瘤的侵袭性生长，单靠手术治疗并不能完全治愈肿瘤的弥漫性生长。目前多采用放疗、化疗等辅助治疗来延缓肿瘤复发时间。但其总体预后及长期生存率仍不容乐观[5]。因此，研究脑胶质瘤发生、发展的机制，探索有效的治疗靶点是目前神经肿瘤领域的研究热点。PCDH18（protocadherin 18)属于钙粘蛋白原基因家族，属于钙粘蛋白超家族的一个亚家族，钙黏蛋白相关的神经元受体被认为在大脑特定细胞-细胞连接的建立和功能中发挥作用。然而其具体功能尚不明确。
近年来，化疗药物取得了一定进展，但患者的预后仍然较差[6]。迫切需要找到有效的治疗方法。因此，寻找有效的治疗方法仍是近年来的研究热点。蜂毒肽是蜂毒的主要活性成分，一些研究[7][8][9]表明，蜂毒肽可抑制恶性人脑胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。蜜蜂毒液的大部分抗肿瘤活性被认为是通过抑制胶质瘤C6细胞中的VEGF、FLT-1和MMP-9[10]、人类胶质母细胞瘤细胞中的Metaloprotease-2[11] 以及胶质瘤SHG44细胞中的STAT3和VEGF实现的[12]。然而，关于蜂毒肽在脑胶质瘤中的研究仍然有限。因此，本研究通过多个数据库联合分析PCDH18在脑胶质瘤中的表达水平及临床意义，同时，验证蜂毒肽对PCDH18的调控作用。
材料与方法
1.1材料
蜂毒肽 将其溶解于生理盐水中，-20°C保存。细胞 胶质瘤U87细胞来源于患者的胶质母细胞瘤组织。U87细胞培养在37°C，5% CO2培养箱中，使用DMEM培养基（Gibco，美国）、10%FBS（Gibco，美国）和1%的青霉素-链霉素。
1.2 方法
1.2.1 脑胶质瘤中PCDH18 mRNA数据及临床资料下载通过TCGA数据库提取脑胶质瘤患者的临床数据和mRNA测序数据，所有样本中PCDH18 mRNA表达水平采用log2转换。Cox回归分析影响脑胶质瘤患者预后的危险因素。
1.2.2 PCDH18 mRNA 在脑胶质瘤中的表达 利用GEPIA ((http://gepia.cancer-pu.cn) 数据库对PCDH18在肿瘤组织样本与正常组织样本中的表达情况进行差异分析，分析比较PCDH18在GBM、LGG与正常组织样本中的表达情况。
1.2.3 免疫浸润分析通过Spearman法在线分析TIMER数据库（http://cistrome.shinyapps.io/timer/)中胶脑质瘤组织PCDH18表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性。
1.2.4 PCDH18表达水平与脑胶质瘤患者生存时间的关系通过K-M曲线法分析GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/)中PCDH18 mRNA表达水平和脑胶质瘤患者中位生存时间的关系。生存率表示患者生存时间大于时间t的概率，用R(t)表示。Time表示患者的实际生存时间。以横轴为后续预防时间t，纵轴为生存概率R(t)，可以得到生存率曲线。
1.2.5 实时荧光定量PCR分析为了确认蜂毒肽对胶质瘤患者预后相关的PCDH18基因的调控作用，采用qPCR方法进行验证。设置二组：蜂毒肽组(150 nM处理12 h)与未处理组（对照组）。1引物设计 使用Primer Premier 5软件设计引物(引物序列如表1所示)。2总RNA的提取及qPCR分析 将U87细胞接种于6孔板(1×106 cells/well)。12 h后，细胞用蜂毒肽(150 nM, 12 h)处理。总RNA采用RNA提取试剂盒(Beyotime, Shanghai, China)分离。使用Nanodrop2000分光光度计(Implen, Los Angeles, USA)检测RNA纯度和浓度。使用cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit (Transgen，北京，中国)进行反转录成cDNA，使用RT-PCR扩增试剂盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix) (Transgen，北京，中国)进行cDNA扩增。采用2-ΔΔCT法，以GAPDH为内参基因，测定基因表达水平。
1.2.6 统计学方法采用GraphPad Prism 7、SPSS 24以及R 4.2.2对数据进行统计学分析。二组间比较采用单因素方差分析(qPCR)。采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。所有检验的显著性定义为P<0 .05为差异有统计学意义。
结果
2.1 PCDH18 mRNA在泛癌中的表达
PCDH18 mRNA在宫颈鳞状细胞癌和腺癌、乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、脑胶质瘤、肺腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺原发性腺癌中等均高表达（P<0.05)，横坐标表示肿瘤类型，纵坐标表示肿瘤和正常组织的中位表达。见图1。
2.2 PCDH18 mRNA 在脑胶质瘤中的表达
GEPIA数据库分析结果表明，PCDH18在GBM与LGG中，与正常组织相比，其表达量均上调，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.3 PCDH18 mRNA与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平相关性
脑胶质瘤中, PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性。其中，PCDH18表达与NK细胞激活（NK cells activated）、单核细胞（Monocytes）、树突状细胞激活（Dendritic cells activated）呈负相关，与巨噬细胞 M0（Macrophages M0）、巨噬细胞 M1（Macrophages M1）、Tregs细胞、中性粒细胞(Neutrophils)的浸润呈正相关性。表明PCDH18的表达差异对glioma的免疫微环境具有影响，并调控肿瘤的免疫状态，见图3。
2.4 PCDH18在LGG中表达与PD-1和PD-L1的相关性
由于免疫治疗的前景广阔，我们进一步确定了PCDH18在LGG中表达与PD-1和PD-L1之间的关系。我们观察到PCDH18与PD-1 (r = 0.22, P= 6.7 e - 07)和PD-L1(r = 0.32, P = 1.6e-13)呈正相关。见图4。
2.5 PCDH18表达和脑胶质瘤患者预后的关系
胶质瘤的RNA-seq数据和临床数据来源于TCGA数据库。对TCGA数据库中脑胶质瘤患者的预后进行Kaplan-Meier分析，并绘制生存曲线。K-M曲线显示，PCDH18高表达的LGG患者中位生存时间降低(p<0.001)，见图5。
2.6 单因素独立预后分析
单因素独立预后分析显示，年龄(p<0.001)、肿瘤分级(p<0.001)、PCDH18(p<0.05)基因表达水平差异显著(表2)。这表明年龄、分期和PCDH18基因的表达水平是生存的重要预测因素。
2.7 多因素Cox回归分析
多因素Cox回归分析显示，PCDH18 (p<0.05)的表达是脑胶质瘤的独立预测因子，与胶质瘤患者的生存关系最为密切。见图6。
2.8 蜂毒肽处理后，PCDH18的实时定量PCR分析
qPCR结果表明蜂毒肽组PCDH18基因表达量明显低于对照组。说明蜂毒肽可以下调脑胶质瘤U87细胞中PCDH18基因的高表达。（结果以均数±SEM表示，例数=3，对照组比较 *p< 0.05;**p < 0.01;***与p < 0.001）。见图7。
讨论
原钙粘附蛋白（protocadherin)是钙粘蛋白超家族中一个最大的亚族。钙粘附蛋白家族为钙离子依赖型粘附分子，均为单链跨膜糖蛋白介导特定组织或器官同型细胞间粘附，对胚胎发育中细胞识别、迁移、通讯和组织分化及中枢神经系统中神经回路的形成具有重要作用。原钙粘附蛋白在神经元发育和突触形成中有重要的作用[13]。但其在肿瘤中的作用鲜少研究。在本研究中，我们通过TCGA数据库，我们发现PCDH18与脑胶质瘤患者的生存相关。PCDH18基因的高表达与生存不良密切相关。它可以作为脑胶质瘤患者预后的独立危险因素。脑胶质瘤中，PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性。进一步发现，PCDH18与PD-1和PD-L1呈正相关，提示PCDH18可能是免疫治疗的重要预后指标，为脑胶质瘤的免疫抑制微环境提供了一个潜在的机制。
尽管脑胶质瘤的诊断和治疗技术不断更新和进步，但患者的预后并不令人满意。蜂毒肽是蜂毒的主要活性成分，蜂毒是一种由工蜂毒腺和副腺分泌的芳香透明毒液，在蜂毒的众多成分中，蜂毒肽的含量最高，占蜂毒的40%以上，是一种由26个氨基酸残基组成的多肽[14]。近年来，对蜂毒肽的药理学作用和机制进行了许多研究。据报道，蜂毒肽具有抗氧化[15]、抗真菌[16]和抗炎[17]药理作用。因此，蜂毒肽被用于治疗多种疾病，尤其是类风湿性关节炎。其机制可能与调节Th17/Treg平衡[18]和抑制IL-6/S IL-6R复合物诱导的NF-kB、STAT3和bcl-2表达有关[19]。
此外，之前的研究表明，蜂毒肽破坏细胞膜并导致细胞死亡。它不需要进入细胞，但可以在细胞外显示细胞毒性来破坏肿瘤细胞[20]。蜂毒肽被认为可以通过抑制肝癌中的HIF-1 α/Akt途径[21]、肺癌细胞中的NF-kB信号通路[22]、肺癌中TGF-β介导的ERK信号通路[23]、三阴性乳腺癌中的Her2富集和生长因子受体激活[24]、黑色素瘤中的MAPK途径[25]和卵巢癌中的JAK2/STAT3途径[26]而具有促凋亡作用和抗肿瘤活性。而在本研究中，我们通过qPCR实验，发现蜂毒肽可调控PCDH18基因在脑胶质瘤U87细胞中的表达，说明蜂毒肽可能是一种潜在的治疗脑胶质瘤的药物。后续需要进一步研究蜂毒肽在治疗胶质瘤中的靶点和作用机制。
此外，蜂毒肽虽然被报道对多种肿瘤具有治疗作用，但其对正常细胞也有细胞毒性，限制了其临床应用[27]。有人提出，这可以通过蜂毒蛋白纳米颗粒的靶向递送来解决[28]。有人开发了蜂毒的经皮递送制剂，如经皮给药的蜂毒涂膜剂，发现在实验剂量范围内是安全的，没有显示出急性或长期毒性[29]。此外，蜂蜇疗法在临床应用中，发现在安全剂量范围内，血、尿、便常规、心电图、肝肾功能均无异常[30]。蜂产品和拔火罐也常与蜂刺疗法联合使用，有效提高了患者的生活质量和生存时间[31]。也有报道称该肽对正常细胞的毒性较小[32]，这可能与肽的浓度有关。因此，可以通过剂量控制或使用给药载体来降低蜂毒肽对正常组织和细胞的毒性。
本研究有一定的局限性，例如蜂毒肽是否通过调控PCDH18调节免疫系统促进肿瘤细胞凋亡，将在我们未来的研究中进一步探索。
参考文献
[1] Gladson CL, Prayson RA, Liu WM. The pathobiology of glioma tumors. Annu Rev Pathol. 2010;5(1):33-50.[2] Delgado-Lopez PD, Corrales-Garcia EM. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clin Transl Oncol. 2016;18(11):1062-1071.[3] Joshi AD, Parsons DW, Velculescu VE, et al. Sodium ion channel mutations in glioblastoma patients correlate with shorter survival. Mol Cancer. 2011;10-17.[4] Śledzińska P, Bebyn Marek G, Furtak J, et al. Prognostic and Predictive Biomarkers in Gliomas. Int J Mol sci. 2021;22(19):10373.[5] Tan AC，Ashley DM，López GY，et al. Management of glioblastoma：state of the art and future directions［J］. CA Cancer J Clin，2020，70（4）：299-312. DOI：10.3322/caac.21613.[6] Yu ZY, Xie GF, Zhou GT, et al. NVP-BEZ235, a novel dual PI3K–mTOR inhibitor displays anti-glioma activity and reduces chemoresistance to temozolomide in human glioma cells. Cancer Lett. 2015;367(1), 58-68.[7] Yang ZL, Ke YQ, Xu RX, et al. Melittin inhibits proliferation and induces apoptosis of malignant human glioma cells. J South Med Univ. 2007;27(11), 1775-1777.[8] Lebel AA, Kisembo MV, Soucy MN, et al. Molecular characterization of the anticancer properties associated with bee venom and its components in glioblastoma multiforme. Chemico-Biological Interactions. 2021; 347.[9] Gajski G, Čimbora-Zovko T, Rak S, Osmak M, et al. Antitumour action on human glioblastoma A1235 cells through cooperation of bee venom and cisplatin. Cytotechnology. 2016; 68(4): 1197-205.[10] 姚兴军,王岳华,侯文仲等. 重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的抑制作用及对VEGF,Flt-1,MMP-9表达的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19 (24): 267-269.[11] Sisakht M, Mashkani B, Bazi A, et al. Bee venom induces apoptosis and suppresses matrix metalloprotease-2 expression in human glioblastoma cells. Brazilian Journal of Pharmacognosy. 2017.[12] 姚兴军,王岳华,侯文仲等. 重组蜂毒肽对胶质瘤SHG44细胞的抑制作用及对STAT3、VEGF表达的影响 [J]. 中国老年学杂志, 2013, 33 (14): 3372-3374.[13] 贡月波，蒋璆，胡晶莹等. 原钙黏附蛋白18b基因抑制对斑马鱼神经系统发育的影响 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2010, 37 (08): 897-903.[14] Terwilliger TC, Eisenberg D. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure. J. Biol. Chem. 1982;257(11), 6016–6022.[15] Somwongin S, Chantawannakul P, Chaiyana W. Antioxidant activity and irritation property of venoms from Apis species. Toxicon. 2018;145, 32-39.[16] Hamed M, Mojtaba M. Anti-fungal properties and mechanisms of melittin. Applied microbiology and biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol. 2020;104 (15), 6513-6526.[17] Lee G, Bae H. Anti-Inflammatory Applications of Melittin, a Major Component of Bee Venom: Detailed Mechanism of Action and Adverse Effects. Molecules. 2016; 21(5), 616.[18] 谭宁,贺守第,关丽等. 蜂毒肽对胶原诱导关节炎大鼠模型Th17/Treg平衡及炎症的影响 [J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29 (02): 1-6.[19] Kim SK, Park KY, Yoon WC, et al. Melittin enhances apoptosis through suppression of IL-6/s IL-6R complex-induced NF-kB and STAT3 activation and Bcl-2 expression for human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(5):471- 477.[20] 王智传,陈琪,刘欣等. 蜂毒肽抗肿瘤作用机制研究进展 [J]. 吉林医药学院学报, 2018, 39 (06): 462-464. [21] Chen QW, Lin WF, Yin ZF, et al. Melittin Inhibits Hypoxia-Induced Vasculogenic Mimicry Formation and Epithelial-Mesenchymal Transition through Suppression of HIF-1 α /Akt Pathway in Liver Cancer. Evid Based Complement Alternat Med. 2019.[22] Choi KE, Hwang CJ, Gu SM, et al. Cancer cell growth inhibitory effect of bee venom via increase of death receptor 3 expression and inactivation of NF-kappa B in NSCLC cells. Toxins (Basel) 2014; 6(8), 2210–2228.[23] Yu RZ, Wang M, Wang MH, et al. Melittin suppresses growth and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells via down-regulation of TGF-β-mediated ERK signal pathway. Braz J Med Biol Res. 2020;54(2), 1414-1431.[24] Duffy C, Sorolla A, Wang E, et al. Honeybee venom and melittin suppress growth factor receptor activation in HER2-enriched and triple-negative breast cancer. NPJ Precis Oncol. 2020;4.[25] Lim HN, Baek SB, Jung HJ. Bee venom and its peptide component melittin suppress growth and migration of melanoma cells via inhibition of PI3K/AKT/mTOR and MAPK pathways. Molecules. 2019;24, 929.[26] Jo M, Park MH, Kollipara PS, et al. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 path-way. Toxicol Appl Pharmacol. 2012;258, 72-81.[27] Gajski G, Garaj-Vrhovac V. Melittin: a lytic peptide with anticancer properties. Environ Toxicol Pharmacol. 2013; 36(2): 697-705.[28] Pan H, Soman NR, Schlesinger PH, et al. Cytolytic peptide nanoparticles (‘NanoBees’) for cancer therapy. Wiley Interdiscip. Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2011; 3(3), 318–327.[29] 高源,朱凤,杨志斌,等. 蜜蜂蜂毒涂膜剂经皮给药的安全性评价 [J]. 中国药房, 2019, 30 (16): 2181-2186.[30] 陈世云. 蜂针治疗类风湿关节炎临床有效性及安全性研究[D]. 广州中医药大学, 2014.[31] 张笑,唐纯志,李万瑶,等. 蜂针治疗肺癌晚期病例探讨 [J]. 亚太传统医药, 2018, 14 (02): 140-143.[32] Dufy C, Sorolla A, Wang E, et al. Honeybee venom and melittin suppress growth factor receptor activation in HER2-enriched and triple-negative breast cancer. npj Precision Oncology.2020;4,24.
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—— PCDH18在脑胶质瘤中的临床意义及蜂毒肽的调控作用 ——
李然1，李万瑶2，郭葵1，徐长琼1*（1韶关学院，广东 韶关 512005；2广州中医药大学，广东 广州510405）
作者徐长琼
【摘要】目的 探讨PCDH18在脑胶质瘤中的表达及其与预后、免疫细胞浸润的关系；蜂毒肽对脑胶质瘤U87细胞中PCDH18基因表达水平的影响。方法 TCGA数据库分析多种肿瘤组织中PCDH18 mRNA的表达水平；GEPIA2数据库、HPA数据、TIMER数据库和LinkedOmic数据库分别分析PCDH18 mRNA的表达水平与脑胶质瘤患者的生存状态的关系，PCDH18与肿瘤组织中免疫细胞浸润水平的相关性。结果 本研究表明，PCDH18在脑胶质瘤高表达（P<0.05）。PCDH18高表达在LGG患者中位生存时间降低P<0.001)。脑胶质瘤中, PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性，PCDH18与PD-1 和PD-L1均呈正相关。PCDH18 mRNA(高表达）是脑胶质瘤患者预后的独立危险因素（P<0.05），与脑胶质瘤患者的预后密切相关。qPCR结果表明蜂毒肽能下调PCDH18在胶质瘤U87细胞中的高表达。结论 PCDH18可作为脑胶质瘤患者预后不良的标志物，与肿瘤免疫细胞浸润相关。PCDH18基因过表达与生存率低相关。qPCR证实蜂毒肽可以下调PCDH18基因在胶质瘤U87细胞中的高表达，蜂毒肽可能是一种治疗胶质瘤的潜在药物。
【关键词】脑胶质瘤；PCDH18；蜂毒肽；预后
Abstract：Objective To investigate the expression of PCDH18 in glioma and its relationship with prognosis and immune cell infiltration. Effect of melittin on PCDH18 gene expression in U87 cells of brain glioma. Methods The expression level of PCDH18 mRNA in various tumor tissues was analyzed by TCGA database. GEPIA2 database, HPA database, TIMER database and LinkedOmic database were used to analyze the relationship between the expression level of PCDH18 mRNA and the survival state of brain glioma patients, and the correlation between PCDH18 and the level of immune cell infiltration in liver cancer tissues. Methods The expression level of PCDH18 mRNA in various tumor tissues was analyzed by TCGA database. GEPIA2 database, HPA database, TIMER database and LinkedOmic database were used to analyze the relationship between the expression level of PCDH18 mRNA and the survival state of brain glioma patients, and the correlation between PCDH18 and the level of immune cell infiltration in liver cancer tissues. Results This study showed that PCDH18 was highly expressed in brain glioma (P<0.05). High expression of PCDH18 decreased median survival time in LGG patients (p<0.001). In brain glioma, PCDH18 was correlated with the infiltration level of immune cells in the tumor microenvironment, and PCDH18 was positively correlated with PD-1 and PD-L1. PCDH18 mRNA(high expression) was an independent risk factor for the prognosis of brain glioma patients (P<0.05), and was closely related to the prognosis of brain glioma patients. The results of qPCR showed that melittin could regulate the expression of PCDH18 in glioma U87 cells. Conclusion PCDH18 can be used as a marker of poor prognosis in glioma patients and is associated with tumor immune cell infiltration. Overexpression of PCDH18 is associated with low survival. qPCR confirmed that MT can regulate the expression of PCDH18 gene in glioma U87 cells, and melittin may be a potential drug for the treatment of glioma.
Key words: glioma; PCDH18；Bee venom peptide; prognosis
概述
脑胶质瘤是最常见的原发性脑恶性肿瘤，该病发病率高，生存率低[1,2,3]。其中，低级别胶质瘤占成人原发性中枢神经系统肿瘤的6%，预后良好[4]。但与其他颅内良性肿瘤相比，仍有较高的复发率。多形性胶质母细胞瘤(GBM)被WHO列为4级，是最具侵袭性和恶性的原发性脑肿瘤，手术是治疗的重要手段。然而，由于胶质瘤的侵袭性生长，单靠手术治疗并不能完全治愈肿瘤的弥漫性生长。目前多采用放疗、化疗等辅助治疗来延缓肿瘤复发时间。但其总体预后及长期生存率仍不容乐观[5]。因此，研究脑胶质瘤发生、发展的机制，探索有效的治疗靶点是目前神经肿瘤领域的研究热点。PCDH18（protocadherin 18)属于钙粘蛋白原基因家族，属于钙粘蛋白超家族的一个亚家族，钙黏蛋白相关的神经元受体被认为在大脑特定细胞-细胞连接的建立和功能中发挥作用。然而其具体功能尚不明确。
近年来，化疗药物取得了一定进展，但患者的预后仍然较差[6]。迫切需要找到有效的治疗方法。因此，寻找有效的治疗方法仍是近年来的研究热点。蜂毒肽是蜂毒的主要活性成分，一些研究[7][8][9]表明，蜂毒肽可抑制恶性人脑胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。蜜蜂毒液的大部分抗肿瘤活性被认为是通过抑制胶质瘤C6细胞中的VEGF、FLT-1和MMP-9[10]、人类胶质母细胞瘤细胞中的Metaloprotease-2[11] 以及胶质瘤SHG44细胞中的STAT3和VEGF实现的[12]。然而，关于蜂毒肽在脑胶质瘤中的研究仍然有限。因此，本研究通过多个数据库联合分析PCDH18在脑胶质瘤中的表达水平及临床意义，同时，验证蜂毒肽对PCDH18的调控作用。
1.1材料
蜂毒肽 将其溶解于生理盐水中，-20°C保存。细胞 胶质瘤U87细胞来源于患者的胶质母细胞瘤组织。U87细胞培养在37°C，5% CO2培养箱中，使用DMEM培养基（Gibco，美国）、10%FBS（Gibco，美国）和1%的青霉素-链霉素。
1.2 方法
1.2.1 脑胶质瘤中PCDH18 mRNA数据及临床资料下载通过TCGA数据库提取脑胶质瘤患者的临床数据和mRNA测序数据，所有样本中PCDH18 mRNA表达水平采用log2转换。Cox回归分析影响脑胶质瘤患者预后的危险因素。
1.2.2 PCDH18 mRNA 在脑胶质瘤中的表达 利用GEPIA ((http://gepia.cancer-pu.cn) 数据库对PCDH18在肿瘤组织样本与正常组织样本中的表达情况进行差异分析，分析比较PCDH18在GBM、LGG与正常组织样本中的表达情况。
1.2.3 免疫浸润分析通过Spearman法在线分析TIMER数据库（http://cistrome.shinyapps.io/timer/)中胶脑质瘤组织PCDH18表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性。
1.2.4 PCDH18表达水平与脑胶质瘤患者生存时间的关系通过K-M曲线法分析GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/)中PCDH18 mRNA表达水平和脑胶质瘤患者中位生存时间的关系。生存率表示患者生存时间大于时间t的概率，用R(t)表示。Time表示患者的实际生存时间。以横轴为后续预防时间t，纵轴为生存概率R(t)，可以得到生存率曲线。
1.2.5 实时荧光定量PCR分析为了确认蜂毒肽对胶质瘤患者预后相关的PCDH18基因的调控作用，采用qPCR方法进行验证。设置二组：蜂毒肽组(150 nM处理12 h)与未处理组（对照组）。1引物设计 使用Primer Premier 5软件设计引物(引物序列如表1所示)。2总RNA的提取及qPCR分析 将U87细胞接种于6孔板(1×106 cells/well)。12 h后，细胞用蜂毒肽(150 nM, 12 h)处理。总RNA采用RNA提取试剂盒(Beyotime, Shanghai, China)分离。使用Nanodrop2000分光光度计(Implen, Los Angeles, USA)检测RNA纯度和浓度。使用cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit (Transgen，北京，中国)进行反转录成cDNA，使用RT-PCR扩增试剂盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix) (Transgen，北京，中国)进行cDNA扩增。采用2-ΔΔCT法，以GAPDH为内参基因，测定基因表达水平。
结果
2.1 PCDH18 mRNA在泛癌中的表达
PCDH18 mRNA在宫颈鳞状细胞癌和腺癌、乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、脑胶质瘤、肺腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺原发性腺癌中等均高表达（P<0.05)，横坐标表示肿瘤类型，纵坐标表示肿瘤和正常组织的中位表达。见图1。
GEPIA数据库分析结果表明，PCDH18在GBM与LGG中，与正常组织相比，其表达量均上调，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
脑胶质瘤中, PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性。其中，PCDH18表达与NK细胞激活（NK cells activated）、单核细胞（Monocytes）、树突状细胞激活（Dendritic cells activated）呈负相关，与巨噬细胞 M0（Macrophages M0）、巨噬细胞 M1（Macrophages M1）、Tregs细胞、中性粒细胞(Neutrophils)的浸润呈正相关性。表明PCDH18的表达差异对glioma的免疫微环境具有影响，并调控肿瘤的免疫状态，见图3。
由于免疫治疗的前景广阔，我们进一步确定了PCDH18在LGG中表达与PD-1和PD-L1之间的关系。我们观察到PCDH18与PD-1 (r = 0.22, P= 6.7 e - 07)和PD-L1(r = 0.32, P = 1.6e-13)呈正相关。见图4。
胶质瘤的RNA-seq数据和临床数据来源于TCGA数据库。对TCGA数据库中脑胶质瘤患者的预后进行Kaplan-Meier分析，并绘制生存曲线。K-M曲线显示，PCDH18高表达的LGG患者中位生存时间降低(p<0.001)，见图5。
单因素独立预后分析显示，年龄(p<0.001)、肿瘤分级(p<0.001)、PCDH18(p<0.05)基因表达水平差异显著(表2)。这表明年龄、分期和PCDH18基因的表达水平是生存的重要预测因素。
多因素Cox回归分析显示，PCDH18 (p<0.05)的表达是脑胶质瘤的独立预测因子，与胶质瘤患者的生存关系最为密切。见图6。
qPCR结果表明蜂毒肽组PCDH18基因表达量明显低于对照组。说明蜂毒肽可以下调脑胶质瘤U87细胞中PCDH18基因的高表达。（结果以均数±SEM表示，例数=3，对照组比较 *p< 0.05;**p < 0.01;***与p < 0.001）。见图7。
原钙粘附蛋白（protocadherin)是钙粘蛋白超家族中一个最大的亚族。钙粘附蛋白家族为钙离子依赖型粘附分子，均为单链跨膜糖蛋白介导特定组织或器官同型细胞间粘附，对胚胎发育中细胞识别、迁移、通讯和组织分化及中枢神经系统中神经回路的形成具有重要作用。原钙粘附蛋白在神经元发育和突触形成中有重要的作用[13]。但其在肿瘤中的作用鲜少研究。在本研究中，我们通过TCGA数据库，我们发现PCDH18与脑胶质瘤患者的生存相关。PCDH18基因的高表达与生存不良密切相关。它可以作为脑胶质瘤患者预后的独立危险因素。脑胶质瘤中，PCDH18与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平呈一定相关性。进一步发现，PCDH18与PD-1和PD-L1呈正相关，提示PCDH18可能是免疫治疗的重要预后指标，为脑胶质瘤的免疫抑制微环境提供了一个潜在的机制。
尽管脑胶质瘤的诊断和治疗技术不断更新和进步，但患者的预后并不令人满意。蜂毒肽是蜂毒的主要活性成分，蜂毒是一种由工蜂毒腺和副腺分泌的芳香透明毒液，在蜂毒的众多成分中，蜂毒肽的含量最高，占蜂毒的40%以上，是一种由26个氨基酸残基组成的多肽[14]。近年来，对蜂毒肽的药理学作用和机制进行了许多研究。据报道，蜂毒肽具有抗氧化[15]、抗真菌[16]和抗炎[17]药理作用。因此，蜂毒肽被用于治疗多种疾病，尤其是类风湿性关节炎。其机制可能与调节Th17/Treg平衡[18]和抑制IL-6/S IL-6R复合物诱导的NF-kB、STAT3和bcl-2表达有关[19]。
此外，之前的研究表明，蜂毒肽破坏细胞膜并导致细胞死亡。它不需要进入细胞，但可以在细胞外显示细胞毒性来破坏肿瘤细胞[20]。蜂毒肽被认为可以通过抑制肝癌中的HIF-1 α/Akt途径[21]、肺癌细胞中的NF-kB信号通路[22]、肺癌中TGF-β介导的ERK信号通路[23]、三阴性乳腺癌中的Her2富集和生长因子受体激活[24]、黑色素瘤中的MAPK途径[25]和卵巢癌中的JAK2/STAT3途径[26]而具有促凋亡作用和抗肿瘤活性。而在本研究中，我们通过qPCR实验，发现蜂毒肽可调控PCDH18基因在脑胶质瘤U87细胞中的表达，说明蜂毒肽可能是一种潜在的治疗脑胶质瘤的药物。后续需要进一步研究蜂毒肽在治疗胶质瘤中的靶点和作用机制。
此外，蜂毒肽虽然被报道对多种肿瘤具有治疗作用，但其对正常细胞也有细胞毒性，限制了其临床应用[27]。有人提出，这可以通过蜂毒蛋白纳米颗粒的靶向递送来解决[28]。有人开发了蜂毒的经皮递送制剂，如经皮给药的蜂毒涂膜剂，发现在实验剂量范围内是安全的，没有显示出急性或长期毒性[29]。此外，蜂蜇疗法在临床应用中，发现在安全剂量范围内，血、尿、便常规、心电图、肝肾功能均无异常[30]。蜂产品和拔火罐也常与蜂刺疗法联合使用，有效提高了患者的生活质量和生存时间[31]。也有报道称该肽对正常细胞的毒性较小[32]，这可能与肽的浓度有关。因此，可以通过剂量控制或使用给药载体来降低蜂毒肽对正常组织和细胞的毒性。
本研究有一定的局限性，例如蜂毒肽是否通过调控PCDH18调节免疫系统促进肿瘤细胞凋亡，将在我们未来的研究中进一步探索。
参考文献
[1] Gladson CL, Prayson RA, Liu WM. The pathobiology of glioma tumors. Annu Rev Pathol. 2010;5(1):33-50.[2] Delgado-Lopez PD, Corrales-Garcia EM. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clin Transl Oncol. 2016;18(11):1062-1071.[3] Joshi AD, Parsons DW, Velculescu VE, et al. Sodium ion channel mutations in glioblastoma patients correlate with shorter survival. Mol Cancer. 2011;10-17.[4] Śledzińska P, Bebyn Marek G, Furtak J, et al. Prognostic and Predictive Biomarkers in Gliomas. Int J Mol sci. 2021;22(19):10373.[5] Tan AC，Ashley DM，López GY，et al. Management of glioblastoma：state of the art and future directions［J］. CA Cancer J Clin，2020，70（4）：299-312. DOI：10.3322/caac.21613.[6] Yu ZY, Xie GF, Zhou GT, et al. NVP-BEZ235, a novel dual PI3K–mTOR inhibitor displays anti-glioma activity and reduces chemoresistance to temozolomide in human glioma cells. Cancer Lett. 2015;367(1), 58-68.[7] Yang ZL, Ke YQ, Xu RX, et al. Melittin inhibits proliferation and induces apoptosis of malignant human glioma cells. J South Med Univ. 2007;27(11), 1775-1777.[8] Lebel AA, Kisembo MV, Soucy MN, et al. Molecular characterization of the anticancer properties associated with bee venom and its components in glioblastoma multiforme. Chemico-Biological Interactions. 2021; 347.[9] Gajski G, Čimbora-Zovko T, Rak S, Osmak M, et al. Antitumour action on human glioblastoma A1235 cells through cooperation of bee venom and cisplatin. Cytotechnology. 2016; 68(4): 1197-205.[10] 姚兴军,王岳华,侯文仲等. 重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的抑制作用及对VEGF,Flt-1,MMP-9表达的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19 (24): 267-269.[11] Sisakht M, Mashkani B, Bazi A, et al. Bee venom induces apoptosis and suppresses matrix metalloprotease-2 expression in human glioblastoma cells. Brazilian Journal of Pharmacognosy. 2017.[12] 姚兴军,王岳华,侯文仲等. 重组蜂毒肽对胶质瘤SHG44细胞的抑制作用及对STAT3、VEGF表达的影响 [J]. 中国老年学杂志, 2013, 33 (14): 3372-3374.[13] 贡月波，蒋璆，胡晶莹等. 原钙黏附蛋白18b基因抑制对斑马鱼神经系统发育的影响 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2010, 37 (08): 897-903.[14] Terwilliger TC, Eisenberg D. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure. J. Biol. Chem. 1982;257(11), 6016–6022.[15] Somwongin S, Chantawannakul P, Chaiyana W. Antioxidant activity and irritation property of venoms from Apis species. Toxicon. 2018;145, 32-39.[16] Hamed M, Mojtaba M. Anti-fungal properties and mechanisms of melittin. Applied microbiology and biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol. 2020;104 (15), 6513-6526.[17] Lee G, Bae H. Anti-Inflammatory Applications of Melittin, a Major Component of Bee Venom: Detailed Mechanism of Action and Adverse Effects. Molecules. 2016; 21(5), 616.[18] 谭宁,贺守第,关丽等. 蜂毒肽对胶原诱导关节炎大鼠模型Th17/Treg平衡及炎症的影响 [J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29 (02): 1-6.[19] Kim SK, Park KY, Yoon WC, et al. Melittin enhances apoptosis through suppression of IL-6/s IL-6R complex-induced NF-kB and STAT3 activation and Bcl-2 expression for human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(5):471- 477.[20] 王智传,陈琪,刘欣等. 蜂毒肽抗肿瘤作用机制研究进展 [J]. 吉林医药学院学报, 2018, 39 (06): 462-464. [21] Chen QW, Lin WF, Yin ZF, et al. Melittin Inhibits Hypoxia-Induced Vasculogenic Mimicry Formation and Epithelial-Mesenchymal Transition through Suppression of HIF-1 α /Akt Pathway in Liver Cancer. Evid Based Complement Alternat Med. 2019.[22] Choi KE, Hwang CJ, Gu SM, et al. Cancer cell growth inhibitory effect of bee venom via increase of death receptor 3 expression and inactivation of NF-kappa B in NSCLC cells. Toxins (Basel) 2014; 6(8), 2210–2228.[23] Yu RZ, Wang M, Wang MH, et al. Melittin suppresses growth and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells via down-regulation of TGF-β-mediated ERK signal pathway. Braz J Med Biol Res. 2020;54(2), 1414-1431.[24] Duffy C, Sorolla A, Wang E, et al. Honeybee venom and melittin suppress growth factor receptor activation in HER2-enriched and triple-negative breast cancer. NPJ Precis Oncol. 2020;4.[25] Lim HN, Baek SB, Jung HJ. Bee venom and its peptide component melittin suppress growth and migration of melanoma cells via inhibition of PI3K/AKT/mTOR and MAPK pathways. Molecules. 2019;24, 929.[26] Jo M, Park MH, Kollipara PS, et al. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 path-way. Toxicol Appl Pharmacol. 2012;258, 72-81.[27] Gajski G, Garaj-Vrhovac V. Melittin: a lytic peptide with anticancer properties. Environ Toxicol Pharmacol. 2013; 36(2): 697-705.[28] Pan H, Soman NR, Schlesinger PH, et al. Cytolytic peptide nanoparticles (‘NanoBees’) for cancer therapy. Wiley Interdiscip. Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2011; 3(3), 318–327.[29] 高源,朱凤,杨志斌,等. 蜜蜂蜂毒涂膜剂经皮给药的安全性评价 [J]. 中国药房, 2019, 30 (16): 2181-2186.[30] 陈世云. 蜂针治疗类风湿关节炎临床有效性及安全性研究[D]. 广州中医药大学, 2014.[31] 张笑,唐纯志,李万瑶,等. 蜂针治疗肺癌晚期病例探讨 [J]. 亚太传统医药, 2018, 14 (02): 140-143.[32] Dufy C, Sorolla A, Wang E, et al. Honeybee venom and melittin suppress growth factor receptor activation in HER2-enriched and triple-negative breast cancer. npj Precision Oncology.2020;4,24.
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