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蜂毒广谱抗肿瘤作用及其机制的初步探索

2018年03月12日已有人阅读病友分享我想学蜂疗

段媛媛1 张燕2*安香珍2 张淼2 赵新2张雅静2

The broad-spectrum antitumor effect of bee venom and initial exploration the mechanism
Abstract Objective: To explore the anti-proliferative and apoptosis-inducing effect of bee venom on differenttumor cells and observe the change of cellular morphology. Methods: CCK-8 method was used to detect the bee venom inhibiting proliferation of different tumor cells and to calculate of IC50; Apoptosis of differenttumor cells were detected by Flow cytometry. The cellular morphology change were observed byInverted microscope. Results: Compared with the control group, bee venom could significantly inhibit the proliferation of liver cancer cell line Hep G-2 and SMMC-7721, lung cancer cell line A549 and NCI-H1650, gastric cancer cell line AGS and BGC-823, breast cancer cell line MCF-7 and colorectal cancer cell line HCT-8（P<0.05）, with the increase of bee venom concentration,the cell proliferation suppression ratio was also gradually increase, and in a dose-dependent manner.Furthermore, bee venom could also induce apoptosis of A549, SMMC-7721 and mcf-7 cells(P<0.05).We found that the cells are smaller and rounding, and the cell membrane shrinkage and dissolution after bee venom treatment tumor cells by Inverted microscope. Conclusion：Bee venom show significant anti-tumor effectsin inhibition cell proliferation and apoptosis-inducing.
Key Words: Bee venom; Cell proliferation; Cell apoptosis; malignant tumor cells; CCK-8; Flow cytometry

蜂毒是一种具有高度生物活性和药理作用的天然生物毒素，由意大利蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌，为带有芳香苦味的透明液体。蜂毒作为中药使用已有近百年历史，其活性成分较为复杂，主要包括多肽类、酶类和非肽类物质，主要有效成分有蜂毒肽、蜂毒神经肽、磷脂酶A2、透明质酸酶、多巴胺和组织胺等。而多肽类中的蜂毒肽为蜂毒的主要组成及活性成分，约占蜂毒干重的50%以上，是由26个氨基酸组成的线性多肽[1]。现代药理学研究证实，蜂毒具有抗炎、抗病毒、镇痛、抑制血小板凝集、抗艾滋病、降血压以及抗肿瘤等广泛的生物学作用[2]，近年来，蜂毒的抗肿瘤作用及其潜在的临床应用价值逐渐受到人们的关注。为确定蜂毒的广谱抗肿瘤作用及对其机制的初步观察，本实验通过CCK-8法和流式细胞凋亡检测观察了蜂毒对多种恶性肿瘤的抑制作用，并通过倒置显微镜初步观察了蜂毒作用肿瘤细胞后，肿瘤细胞发生的形态学变化，初步推断蜂毒抗肿瘤的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株人肺癌细胞系A549、NCI-H1650购买于上海细胞库，人肝癌细胞系Hep G2、SMMC-7721，胃癌细胞系AGS、BGC-823、乳腺癌细胞系MCF-7以及结直肠癌细胞系HCT-8均由河北科技大学药理实验室常规保种。其中Hep G2和MCF-7使用MEM培养基，A549和AGS使用F12K培养基,其余细胞系均使用RPMI-1640培养基，用含10%胎牛血清、1% L-glutamine 和1%青链霉素(P/S)培养。取对数生长期的细胞进行实验。
1.1.2 药物及试剂蜂毒由北京蜜蜂原蜂产品研究所徐景跃教授提供；MEM培养基、F12K培养基和RPMI-1640培养基均购自corning公司；胎牛血清购自美国Bovogen公司；CCK-8试剂盒购自庄萌生物公司；FITC Annexin Ⅴ/PI凋亡试剂盒购自于BD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CCK-8法检测蜂毒对不同肿瘤细胞增殖的影响
选取处于对数生长期的肿瘤细胞，消化制成单细胞悬液后调整细胞数为7000个/100μl，接种于96孔板中，100μl/孔，培养24h后，实验组加入100μl含不同终浓度蜂毒（2.5、5、10、20、30、40μg/mL）的完全培养基，对照组加入不含药物的相应培养基，调零组只加培养基，不加细胞，共8组，每组6个复孔。继续培养48h后每孔加入10μl CCK溶液，注意不要产生气泡，培养箱孵育1-4h后酶标仪测定450nm处的吸光度值。细胞抑制率=（对照组OD值-调零组OD值）-（实验组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）。结合肿瘤细胞抑制率通过SPSS软件（直线回归）计算蜂毒作用不同肿瘤细胞的IC50值。实验重复3次。
1.2.2 FITC Annexin Ⅴ/PI双染法检测蜂毒对不同种类肿瘤细胞系诱导凋亡的作用
取处于对数生长期的肿瘤细胞系，消化制成单细胞悬液后调整细胞数为7×104个/ml，接种于24孔板中，每孔1ml，培养24h后，实验组分别加入终浓度为5μg/mL和10μg/mL（使用完全培养基配制）的蜂毒稀释液，每组2个复孔，对照组加不含药物的完全培养基，继续培养24h后收取细胞，胰酶消化，收集细胞于15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，4℃预冷PBS洗两遍，离心弃上清，使用预先配制好的1×Binding Buffer 100μl重悬细胞，并将细胞悬液转移至流式管中，按分组分别加入5μl FITC Annexin Ⅴ和5μl PI染料震荡混匀，室温避光孵育15min后加入400μl 1×Binding Buffer混匀，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.2.3 倒置显微镜下观察蜂毒作用肿瘤细胞后细胞形态变化
利用1.2.2实验中实验组不同终浓度蜂毒（5μg/mL和10μg/mL）作用不同肿瘤细胞系24h后，在进行流式检测细胞凋亡前先在倒置显微（OLYMPUS）下观察细胞形态变化，并在10×放大倍数下拍照记录不同肿瘤细胞系图片。
1.2 统计学方法
数据采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量数据以±s或M±QR表示，组间比较以单因素方差分析或K W-H秩和检验进行统计分析，LSD法进行各组间两两比较，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 蜂毒对不同肿瘤细胞系增殖的影响
不同浓度（2.5、5、10、20、30、40μg/mL）蜂毒作用于不同肿瘤细胞48h，均显示明显增殖抑制作用（P<0.05 图1）。肝癌细胞系SMMC-7721各浓度组抑制率分别为（20.43±3.01）%、（34.65±2.11）%、（73.68±3.6）%、（86.66±3.64）%、（94.47±0.91）%、（97.26±1.58）%；Hep G2分别为（6.92±0.58）%、（22.24±2.15）%、（55.74±1.56）%、（76.25±4.61）%、（86.93±5.32）%、（98.61±1.81）%；肺癌细胞系A549各浓度组抑制率分别为（13.63±2.22）%、（25.95±0.49）%、（55.31±2.77）%、（65.87±4.29）%、（80.68±4.36）%、（96.07±1.93）%；NCI-H1650分别为（19.91±1.67）%、（32.51±2.4）%、（62.64±1.99）%、（73.3±5.21）%、（81.68±2.93）%、（96.41±1.0）%；胃癌细胞系AGS各浓度组抑制率分别为（8.19±1.56）%、（20.45±3.53）%、（52.94±1.15）%、（69.61±3.45）%、（84.88±1.38）%、（96.68±1.72）%；BGC-823分别为（17.28±1.4）%、（36.1±1.5）%、（53.58±0.74）%、（72.38±1.69）%、（86.66±1.71）%、（96.53±1.45）%；乳腺癌细胞系MCF-7各浓度组抑制率分别为（12.47±0.79）%、（25.63±3.48）%、（50.07±1.53）%、（65.63±1.01）%、（81.65±1.49）%、（96.03±1.81）%；结直肠癌细胞系HCT-8各浓度组抑制率分别为（17.81±0.68）%、（32.07±1.14）%、（55.50±1.26）%、（84.48±0.7）%、（91.01±1.02）%、（97.3±0.7）%。各细胞系与相应对照组比较，随着蜂毒浓度增大，细胞增殖抑制率也随之增大，并呈现剂量依赖性（P<0.05)。不同细胞系IC50值见表1。

图1 不同终浓度蜂毒作用不同肿瘤细胞系48h的增殖抑制率曲线
表1 蜂毒作用于不同肿瘤细胞48h的半数抑制浓度（IC50）
药物名称    癌症种类    细胞系    IC50（μg/mL）
蜂毒    肝癌    Hep G2    9.469
        SMMC-7721    6.03
    肺癌    A549    9.73
        NCI-H1650    7.763
    胃癌    AGS    10.319
        BGC-823    8.138
    乳腺癌    MCF-7    10.151
    结直肠癌    HCT-8    7.613
2.2 蜂毒诱导A549、SMMC-7721和MCF-7细胞凋亡的作用
根据蜂毒作用A549、SMMC-7721和MCF-7的IC50值，实验组分为：5μg/mL和10μg/mL浓度组，作用时间24h。如图2所示，右下角区域为Annexin Ⅴ-FITC阳性PI阴性细胞，代表早期凋亡率，右上角区域为Annexin Ⅴ-FITC阳性PI阳性细胞，代表晚期凋亡率，细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。随着蜂毒肽浓度增加，三种细胞系的凋亡率也随之增大，与对照组比较，实验组凋亡率具有显著性差异（P<0.05）。结果见表2、图2。

表2 蜂毒作用不同肿瘤细胞24h后流式检测细胞凋亡率结果
细胞系    蜂毒肽浓度（μg/mL）    凋亡率
A549    0    6.53±2.15
    5    28.07±1.43*
    10    68.97±3.6*
SSMC-7721    0    4.08±0.78
    5    39.98±1.57*
    10    74.39±4.28*
MCF-7    0    3.84±0.66
    5    16.62±1.93*
    10    41.04±1.74*
注：*代表与对照组比较P<0.05，差异有统计学意义

3 讨论
蜂毒作为一种天然生物毒素，在中医学上的应用由来已久。其多由意大利蜜蜂工蜂毒腺所分泌，是一种带有芳香气味的透明液体，成分较复杂，主要含有蛋白质类、酶类、肽类、生物胺类和其他未知物质[3]，主要功能物质包括蜂毒肽（Melittin）、蜂毒明肽、磷脂酶A2、透明质酸酶等。近年来，国内外众多学者对蜂毒的活性成分及其基因结构、药理作用机制、分子生物学等方面进行了广泛的研究和探索，，发现其在抗炎、抗病毒、镇静、降压和抗肿瘤等方面均能发挥重要作用，关于蜂毒抗肿瘤活性的研究更是引起许多学者的关注。目前已有研究表明[4, 5]，蜂毒及其主要成分蜂毒肽在体外对多种恶性肿瘤细胞系具有广谱抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制主要是通过直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡以及调节机体免疫力等方面发挥作用。国内学者王居祥等发现[6]，蜂毒注射液可使肿瘤稳定，减慢其生长速度，与化学治疗联合应用可发挥协同作用。另有研究则表明，蜂毒中的蜂毒肽具有明显的抗肿瘤活性，可诱导多种体外培养肿瘤细胞凋亡，如肝癌细胞系BEL-7402[7]、胃癌细胞系SGC-7901[8]和人骨肉瘤细胞MG63[9]等。吕立国等[10]在前列腺癌中的研究中也发现，蜂毒注射液可诱导前列腺癌细胞（PC-3）凋亡，并可能是通过升高胞质中ca＋的浓度，进而激活凋亡相关通过，促进前列腺癌细胞的凋亡。但总体来说，蜂毒抗肿瘤作用机制的研究，目前还缺乏更深入的了解，其药理价值的大小，还需进一步研究和开发。。
为了进一步确定蜂毒的抗肿瘤效应，本实验首先通过细胞毒性实验CCK-8法检测了不同终浓度蜂毒对不同种类肿瘤细胞系的抗增殖作用，实验结果显示，无论是肺癌细胞系、肝癌细胞系、胃癌细胞系、乳腺癌细胞系还是结直肠癌细胞系，蜂毒均显示出明显的抑制增殖作用，且随着蜂毒浓度增加，增殖抑制率也明显增大，都呈现除明显的剂量依赖性（P<0.05）。此实验结果说明蜂毒在抗肿瘤方面确实发挥重要作用，且具有广谱性。接下来通过流式细胞凋亡实验观察蜂毒的诱导肿瘤细胞凋亡作用，结果显示，与对照相比，5μg/mL和10μg/mL浓度组的细胞凋亡率均明显增加（P<0.05），且5μg/mL与10μg/mL浓度组比较，差异也具有统计学意义（P<0.05），此实验结果进一步证明了蜂毒可通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。以上作用在不同肿瘤之间，并未显示明显区别。最后我们又使用倒置显微镜观察了蜂毒作用不同肿瘤细胞24h后细胞死亡情况。结合文献[11]可知，蜂毒中的蜂毒肽为两亲性多肽，具有膜活性，可直接对细胞的磷脂膜产生溶解作用并能插入细胞膜中形成孔道，破坏细胞膜而导致细胞死亡。从图中我们也可看到，随着蜂毒浓度增大，肿瘤细胞明显缩小变圆，且高浓度组细胞膜皱缩，并有部分细胞膜不完整，细胞呈现溶解状态。但具体机制还需进一步深入研究探索。
综合以上实验结果，初步得出蜂毒可通过抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡发挥着广谱抗肿瘤作用。然而，蜂毒及其主要成分蜂毒肽的药理学作用极其复杂，还有许多未知成分的药理作用不十分清楚，且其抗肿瘤机制的研究仍不深入，虽然蜂毒在抗肿瘤方面有很大的潜在价值，但广泛应用于临床还需学者进一步的研究和探索。

参考文献
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[4]Liu CC, Hao DJ, Zhang Q, et al. Application of bee venom and its main constituent melittin for cancer treatment. Cancer Chemother Pharmacol. 2016 Dec;78(6):1113-1130.
[5]李玉梅,陈永强,顾伟. 蜂毒及其主要成分蜂毒素抗肿瘤机制研究进展[J]. 中国中医药信息杂志,2008,01:96-97.
[6]王居祥,朱超林,工瑞平,等蜂毒注射液治万恶性肿瘤的临床观察[J].南京中医药大学学报,2006,22(3):157一159.
[7]张晨，万旭英，李柏，等# 蜂毒素对肝癌细胞系BEL-7402细胞凋亡的影响[J]. 安徽中医学院学报，2003，22( 4) : 44-46
[8]王怡苹. 蜂毒素对胃癌细胞系SGC-7901细胞的抑制作用及与细胞凋亡的关系[D]. 合肥: 安徽医科大学，2010.
[9]樊强. 蜂毒素抑制人骨肉瘤细胞 BG63 活力及其作用机制的实验研究[D]. 济南: 山东大学，2014.
[10]吕立国,张娴,吴巧玲,陈志强,白遵光,王昭辉,代睿欣,王树声. 蜂毒注射液对前列腺癌细胞凋亡的影响研究[J]. 中国老年保健医学,2015,03:3-6.
[11]Van den Bogaart G, Guzmán JV, Mika JT, Poolman B. On the mechanism of poreformation by melittin. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):33854-7. doi:10.1074/jbc.M805171200. Epub 2008 Sep 25.