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蜂毒肽对不同非小细胞肺癌细胞系增殖和凋亡作用的影响

2018年03月12日已有人阅读病友分享我想学蜂疗

段媛媛张淼安香珍赵新张燕
（河北医科大学附属人民医院）

Effects of melittin on Cells proliferation and Apoptosis of different Non-small cell lung caner cells
Abstract Objective: To observe the change of proliferation and apoptosis of melittin on different types of Non-small cell lung cancer cells. Methods:The proliferation ability and apoptosis-inducing of different NSCLC cells A549(EGFR wild type), PC-9(EGFR mutation and EGFR-TKIs sensitive) and NCI-H1975(EGFR mutation and EGFR-TKIs resistance) were detected by CCK-8 assay and Flow cytometry. Results: Compared with the control group, melittin could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of NSCLC cells A549, PC-9 and NCI-H1975 (P<0.05); With the increase of melittin concentration, the cell proliferation suppression ratio was also gradually increase, and in a dose-dependent manner. Furthermore, melittin has the stronger inhibitory effect on the A549 cells (P<0.05). Conclusion：Melittin play an important role in inhibition cell proliferation and apoptosis-inducing of NSCLC.
Key Words: Melittin; Cell proliferation; Cell apoptosis; NSCLC; IC50

蜂毒肽（melittin）是一种碱性蛋白质，具有多种复杂的药理学作用[1]，其作为蜂毒的主要活性成分，约占蜂毒干重的50%以上。蜂毒肽分子结构较为独特，具有潜在膜活性，其寡聚体可在细胞膜上形成亲水性小孔，促使胞内离子外流，改变渗透压，进而导致细胞组织溶解，如可引起红细胞溶血，促使肥大细胞释放组胺，进而发挥抗炎、抗病毒等作用[2]。近年来，蜂毒肽因其独特的药理作用，在抗肿瘤领域逐渐引起国内外学者的广泛关注，因此本研究初步从细胞水平，对蜂毒肽的抗肺癌作用和特点进行了探索。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株人肺腺癌细胞系A549（EGFR野生型）、人肺腺癌细胞系PC-9(EGFR突变型，对EGFR-TKI敏感)和人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975（T790M突变，对EGFR-TKI耐药）均购买于上海细胞库。其中A549细胞使用含10%胎牛血清的F12K培养基培养，PC-9和NCI-H1975使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。隔天换液，取对数生长期细胞进行实验。
1.1.2 药物及试剂蜂毒肽购买于Cayman Chemical(17494)，纯度≥95%，分子量为2846.5KD；F12K培养基和RPMI-1640培养基均购自corning公司；胎牛血清购自美国Bovogen公司；CCK-8试剂盒购自庄萌生物公司；FITC Annexin Ⅴ/PI凋亡试剂盒购自于BD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CCK-8法检测蜂毒肽对不同种类NSCLC细胞系增殖的影响
取处于对数生长期的不同肿瘤细胞，消化制成单细胞悬液后调整细胞数为7000个/100μl，接种于96孔板中，100μl/孔，培养24h后，实验组加入100μl含不同终浓度蜂毒肽（0.5、1、2、3、4、5μg/mL）的完全培养基，对照组加入不含药物的相应培养基，调零组只加培养基，不加任何细胞，每组6个复孔。继续培养48h后每孔加入10μl CCK溶液，注意不要产生气泡，培养箱孵育1-4h后酶标仪测定450nm处的吸光度值。细胞抑制率=（对照组OD值-调零组OD值）-（实验组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）。结合肿瘤细胞抑制率通过SPSS软件（直线回归）分别计算蜂毒肽作用三种肺癌细胞系的IC50值。实验重复3次。
1.2.2 FITC Annexin Ⅴ/PI双染法检测蜂毒肽诱导不同种类NSCLC细胞系凋亡的作用
分别取处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞系，接种于24孔板中，7×104个/孔，培养24h后，实验组分别加入2μg/mL、3μg/mL和4μg/mL终浓度（使用完全培养基配制）的蜂毒肽，每组2个复孔，对照组加不含药物的完全培养基，继续培养24h后收取细胞，胰酶消化，收集细胞于15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，4℃预冷PBS洗两遍，离心弃上清，使用预先配制好的1×Binding Buffer 100μl重悬细胞，并将细胞悬液转移至流式管中，按分组分别加入5μlFITC Annexin Ⅴ和5μlPI染料混匀，室温避光孵育15min后再加入400μl1×Binding Buffer混匀，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.2 统计学方法
数据采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量数据以±s或M±QR表示，组间比较以单因素方差分析或K W-H秩和检验进行统计分析，LSD法进行各组间两两比较，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 蜂毒肽对NSCLC细胞系A549、PC-9和NCI-H1975的增殖抑制作用
不同终浓度蜂毒肽（0.5、1、2、3、4、5μg/mL）作用于不同种类NSCLC细胞系48h后，无论是对EGFR野生型还是EGFR突变型，以及无论是对EGFR-TKI敏感还是耐药的细胞系，均显示明显增殖抑制作用，且与对照组比较，随着蜂毒肽浓度增大，细胞增殖抑制率也随之增大，并呈现剂量依赖性（P<0.05），见表1。各细胞系IC50值（见表1）；LSD法对三种细胞系IC50值进行两两比较发现，蜂毒肽对EGFR野生型的A549有更强的增殖抑制作用（P<0.05），而对EGFR-TKI敏感及耐药细胞系间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

注：*代表与对照组比较P<0.05，差异有统计学意义
2.2 蜂毒肽诱导A549、PC-9和NCI-H1975细胞凋亡的作用
根据蜂毒肽作用A549、PC-9和NCI-H1975的IC50值，实验组设为两组：2μg/mL和3μg/mL浓度组，作用时间24h。流式检测结果如图1所示，右下角区域为Annexin Ⅴ-FITC阳性PI阴性细胞，代表早期凋亡率，右上角区域为Annexin Ⅴ-FITC阳性PI阳性细胞，代表晚期凋亡率，细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。从图、表中可看出，蜂毒肽可明显诱导不同类型NSCLC细胞系凋亡，并对EGFR野生型的A549细胞具有更强的促进凋亡作用（P<0.05），且与对照组比较，各细胞系实验组凋亡率具有显著性差异（P<0.05）。

3 讨论
蜂毒肽（Melittin）做为蜂毒主要活性成分，是由26个氨基酸组成的两亲性线性肽，具有膜结合性和膜蛋白跨膜螺旋的特征，可与膜自然结合，直接溶解细胞膜，导致细胞死亡，在抗炎、抗风湿、镇痛、抗菌抗病毒、调节机体免疫力及抗肿瘤等方面发挥重要生物学作用。Kubo H[3]等用5种细胞毒的实验方法对蜂毒肽与嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白进行比较，结果证实蜂毒肽能插入K562细胞的胞膜中进而形成孔道，引起Ca2+的内流，导致细胞内Ca2+浓度升高，细胞裂解。另外，Van den Bogaart G等[4]又进一步对蜂毒肽作用细胞膜的钻孔机理进行深入探究，提出了蜂毒肽对两亲性磷脂体组成的细胞膜同时存在着两种作用模式：键合和钻孔，而且这两种模式互相竞争。这就为蜂毒肽较高的生物活性奠定了基础，并引起众多国内外学者关注其抗肿瘤的活性。
既往有研究发现[5-7]，蜂毒肽不仅可抑制肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株BGC-823增殖并能诱导其凋亡。Moon DO等[8]在人白血病U937细胞系的研究中证实，Melittin可通过下调磷酸化AKT表达，启动依赖Bcl-2/Caspase-3的凋亡信号通路，进而诱导肿瘤细胞发生凋亡。Rai DK等[9]通过研究证实，蜂毒肽是一种膜活性肽，可与细胞膜的磷脂双分子层中的磷脂酰胆碱和磷酯酰丝氨酸作用，破坏细胞膜，导致细胞外Ca+内流，进而诱导细胞凋亡。Li B等[10]通过一系列体外实验发现，蜂毒肽可使人肝癌细胞系Bel-7402生长发生停滞，并诱导其凋亡。另外，有研究[11]通过采用质谱法和Biolog微阵列技术等代谢组学方法发现，相较于顺铂敏感的卵巢癌细胞，蜂毒肽对顺铂耐药的卵巢癌细胞有更明显的抑制作用，IC50值更小（6.8 vs 4.5μg/mL），由此实验结果可知，蜂毒对耐药细胞系也有作用。但目前关于蜂毒肽在非小细胞肺癌中的研究相对较少，因此本通过通过增殖及凋亡实验初步探讨了蜂毒肽对不同特点的NSCLC细胞系增殖及凋亡作用的影响。
首先，为了了解蜂毒肽对不同NSCLC细胞系的增殖抑制作用，我们采用CCK-8法检测不同终浓度蜂毒肽分别作用于NSCLC细胞系A549(EGFR野生型)、PC-9(EGFR突变型，对TKI敏感)和NCI-H1975(EGFR突变，对TKI耐药)48h后的细胞增殖情况，实验结果发现，蜂毒肽对三种NSCLC细胞系均具有明显抗增殖作用（P<0.05），随着蜂毒肽浓度增加，抑制作用越明显，呈剂量依赖关系；且统计学比较发现蜂毒肽对EGFR野生型的A549细胞的抑制作用相较于其他两种EGFR突变细胞系更强， IC50值更小（P<0.05），而两种EGFR突变细胞系间比较差异无统计学意义（P>0.05）;此实验结果证实了蜂毒肽对NSCLC细胞系的增殖抑制作用，并发现针对EGFR野生型的细胞，蜂毒肽可能有更好的抑制效果，但机制目前还不清晰。接下来我们通过流式细胞凋亡检测进一步了解蜂毒肽的抗肿瘤作用，实验结果发现，与相应细胞对照组比较，蜂毒肽可明显诱导三种NSCLC细胞的凋亡（P<0.05），且对A549细胞的凋亡诱导作用更强（P<0.05），结果与增殖实验结果较一致；统计分析各细胞系不同浓度组凋亡率发现，不同浓度组（2μg/mL和3μg/mL）间比较差异仍具有统计学意义（P<0.05），说明随着蜂毒肽浓度增大，细胞凋亡率也越高。此结果进一步证明了蜂毒肽也可诱导NSCLC细胞系的凋亡，是其发挥抗肿瘤作用机制之一，但其诱导凋亡的具体机制还需进一步实验探究。以上研究初步说明，蜂毒肽可能对EGFR野生患者的抗肿瘤作用更为明显，为没有机会接受EGFR-TKI治疗的患者提供了更好治疗选择；而对于EGFR突变患者，蜂毒肽的抗肿瘤作用不会受耐药产生的影响，从另外一个角度说明该药物的独到之处。
近几年关于蜂毒肽抗肿瘤作用及其相关机理的研究已有很多，并已证实蜂毒肽是一个非常具有应用前景的抗肿瘤天然药物。但是其临床却有很多局限性，一是其较强的溶血毒性，二是其获得的局限性，使蜂毒肽的临床广泛应用受到束缚，但随着医疗科技的进步，我们对其研究的逐步深入，相信这些问题都能得到逐步解决，蜂毒肽在抗肿瘤领域内也将逐渐开发出更多功能，为众多肿瘤患者带来福音。

参考文献
1.于琨瑛，杨慧.蜂毒变应原及蜂毒免疫治疗［J］.生命的化学，2006,26(4):358.
2.陈会良,贺绍君. 蜂毒化学成分及其作用机理研究进展[J]. 安徽农业科学,2014,05:1406-1408.
3.Kubo H, Loegering DA, Tohda Y, Bankers-Fulbright J, Weiler CR, Nakajima H,Thomas LL, Adolphson CR, Gleich GJ. Discordant and anomalous results among cytotoxicity assays: the confounding properties of eosinophil granule major basic protein on cell viability assays. J Immunol Methods. 1999 Jul 30;227(1-2):1-15.
4.Van den Bogaart G, Guzmán JV, Mika JT, Poolman B. On the mechanism of pore formation by melittin. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):33854-7. doi: 10.1074/jbc.M805171200. Epub 2008 Sep 25.
5.曹清心,汪晨,刘宇,赵丹,凌昌全. 蜂毒素对人肝癌细胞中HMGB1及VEGF-C表达的影响[J]. 东南国防医药,2012,02:101-104.
6.黄舒然,王瑞平,邹玺,周锦勇. 蜂毒素对人胃癌细胞株BGC-823凋亡及其细胞周期的影响[J]. 西部中医药,2012,10:15-17.
7.黄舒然,邹玺,周锦勇,王瑞平. 蜂毒素对胃癌细胞株BGC-823生物行为学的影响[J]. 时珍国医国药,2013,05:1068-1070.
8. Moon DO, Park SY, Choi YH, et al. Melittin induces Bcl-2 and caspase-3-dependent apoptosis through downregulation of Akt phosphorylation in human leukemic U937 cells. Toxicon. 2008 Jan;51(1):112-20.
9.Rai DK, Qian S, Heller WT. The Interaction of Melittin with Dimyristoyl Phosphatidylcholine-Dimyristoyl Phosphatidylserine Lipid Bilayer Membranes. Biochim Biophys Acta. 2016 Nov;1858(11):2788-2794.
10.Li B, Gu W, Zhang C, Huang XQ, Han KQ, Ling CQ. Growth arrest and apoptosis of the human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 induced by melittin. Onkologie. 2006 Sep;29(8-9):367-71.
11.Alonezi S, Tusiimire J, Wallace J, Dufton MJ, Parkinson JA, Young LC, Clements CJ, Park JK, Jeon JW, Ferro VA, Watson DG. Metabolomic Profiling of the Effects of Melittin on Cisplatin Resistant and Cisplatin Sensitive Ovarian Cancer Cells Using Mass Spectrometry and Biolog Microarray Technology. Metabolites. 2016 Oct 13;6(4).